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硅胶为基质的磺酸基阳离子交换色谱柱的色谱行为


磺酸基阳离子交换柱


磺酸基阳离子交换柱是在高纯度的惰性硅胶表面键合一种新型的聚合磺酸基阳离子交换配位体。这种独特的键合结构是一种稳定的聚合包膜结构,比普通的聚合物离子交换柱柱效更高,且具有更好的机械强度和重现性。对于阳离子交换分离蛋白和多肽,300Å的孔径设计非常理想,并且同样适用于神经传递素、维生素和季胺除草剂的分离。 SCX色谱柱填装工艺精良,在大多数的运用中,包括作为蛋白二维分析的第一步分离,都表现出了极好的柱效和重现性。


磺酸基阳离子交换固定相是一种常见的阳离子交换固定相,离子交换功能基为苯磺酸,通常将其健合在有机聚合物基质(如苯乙烯-乙基乙烯苯)或硅胶基质上,前者耐酸碱,常用于离子色谱法分析无机阳离子,后者机械性强,常用于普通HPLC分析有机化合物阳离子。

 

以硅胶为基质的磺酸基阳离子交换固定相简称为SCX, 功能基团为大多为苯磺酸。目前市面上有多种品牌,pH适用范围一般为2~8,磺酸基均以离子型存在,为强阳离子交换色谱柱。本文主要探讨组分在SCX柱上的保留行为。


一、基于强阳离子交换的色谱行为


1.原理

主要是基于样品阳离子与淋洗液中阳离子在离子交换剂上进行的可逆交换。离子与固定相之间电荷库仑力之间的差异导致样品的保留差异。

 

以一价阳离子为例,样品阳离子S+与淋洗阳离子E+在磺酸基离子交换位点上存在竞争关系:



由此得到样品在固定相和流动相中的分配系数K:



由于洗脱离子浓度远大于样品离子浓度,故[E+]s接近于离子交换柱容量CR,所以:


KSE为样品阳离子选择性系数KSH+与淋洗阳离子选择性系数KEH+的比值,即:

离子的选择性系数是以H+为淋洗液洗脱该阳离子(X+)时的离子交换平衡常数,即:


Phe-SO3-X+ + H+  ←→ Phe-SO3-H+ + X+ 的平衡常数。


它以H+作为参照,反映了离子交换剂对离子的亲和程度。


由此可见,分配系数



它与温度、离子(样品离子、洗脱离子)与离子交换剂间的作用力、离子交换剂柱容量及洗脱离子浓度有关。

 

由于容量因子K’=K/β(β为相比),故上述影响K的因素都会影响容量因子的因素,当然也影响了保留值。


2.样品阳离子KSH+对保留的影响

 

KSH+反映了样品阳离子与离子交换剂之间的作用力。不同离子KSH+不同,一般离子的荷电越高,水合离子半径越大,KSH+越大,K也就越大。

 

3.pH对保留的影响


有些有机弱碱类药物,可以通过调节流动相pH来调节组分离子型-分子型比例来调节保留。此时容量因子k’为:



x为各存在方式的占比,k’为相应的容量因子。

 

对于多元有机弱碱,同理也可以通过调节流动相pH来调节不同价阳离子组分的比例来调节保留。


图1


4.洗脱液阳离子KEH+对保留的影响


KEH+反映了洗脱液阳离子与离子交换剂之间的作用力。不同离子KEH+不同,一般离子的荷电越高,水合离子半径越大,KEH+越大,被分离组分K’也就越小。


对于常用的洗脱阳离子,一般洗脱能力K+>NH4+>Na+。?


图2


图2为相同浓度的K+、NH4+、Na+离子对(1) 的洗脱色谱图。


(1)

 

有文献报道,在磺酸基阳离子交换剂上,K+、NH4+、Na+的洗脱能力(KEH+)的比值为1.4:1.2:1。笔者以流动相中阳离子浓度比K+:NH4+:Na+=1.4:1.2:1的流动相洗脱两个季铵盐类化合物的混合物,对该结论进行了验证,结果见图3。?


图3


式(5)表明,对于一价样品离子,组分容量因子与洗脱液阳离子浓度成反比。而对于二价样品离子,则有:


                                         

这表明洗脱液离子浓度的改变对高价离子的保留的影响大于对低价离子保留的影响,当洗脱液离子浓度增加1倍时,一价样品离子的容量因子降低一半,而二价样品离子的容量因子将降低至原来的1/4,这对样品离子选择性的改变有着非常重要的意义。


6.分离度与离子种类


当两个阳离子化合物分离不好,大家又不希翼增加保留时间,那能否通过改变洗脱液离子种类改善分离呢?大家知道:



在容量因子k’不变的情况下,要改变分离度R,只能改变选择性因子α。

对于前后被洗脱的两个组分,


      

K2、K1为组分分配系数。根据式(5),有


该式表明,α只与两个组分的选择性系数有关,而与离子种类和离子浓度无关。图3中的结果验证了这一结论,在保持容量因子几乎不变的情况下采用K+、NH4+、Na+分离(2)与(1),分离度没有显著差异。


(2)


二、基于疏水作用的色谱行为


SCX固定相除磺酸基阳离子交换位点外,还有苯基这一疏水作用位点,其保留作用类似于苯基固定相,主要是疏水作用和与含双键组分的π-π相互作用。

 

图4为甲苯在SCX柱上的保留行为。甲苯作为一种电中性的强疏水性化合物,与固定相之间不存在离子交换作用,也不存在与极性磺酸基团间的亲水相互作用,甲苯的保留,可以视为与固定相上苯基相互作用的结果,其保留随着流动相中有机相比例增大而减小,也与疏水作用色谱原理吻合。

 

对于疏水性强的阳离子化合物,该疏水作用会成为组分保留的一种重要的方式之一,有时这种作用甚至会强于离子交换作用。


图4


图4为甲苯在SCX柱上的保留行为。甲苯作为一种电中性的强疏水性化合物,与固定相之间不存在离子交换作用,也不存在与极性磺酸基团间的亲水相互作用,甲苯的保留,可以视为与固定相上苯基相互作用的结果,其保留随着流动相中有机相比例增大而减小,也与疏水作用色谱原理吻合。

 

对于疏水性强的阳离子化合物,该疏水作用会成为组分保留的一种重要的方式之一,有时这种作用甚至会强于离子交换作用。



图5是流动相中有机相比例不同时疏水性季铵盐(1)的保留行为,起初当流动相乙腈比例增加,组分保留减小,此因疏水作用存在的缘故;当乙腈增加到一定程度,组分保留反而增加,此因乙腈比例增加导致流动相中盐浓度减少,影响了离子交换保留的缘故。


三、基于亲水作用色谱的色谱行为


SCX固定相上强极性的磺酸基可以起到类似亲水作用色谱(HILIC)的保留作用。笔者以极性化合物α-吡咯烷酮为例,探讨极性物质在SCX上的保留行为。


图6


图6为不同比例乙腈-水作为流动相时α-吡咯烷酮的保留值,在低乙腈比例的流动相下,苯基上的疏水作用是主要的,随着乙腈比例的增加,α-吡咯烷酮的保留值减小;在高乙腈比例的流动相下,磺酸基表现出的HILIC作用是主要的,随着乙腈比例的增加,α-吡咯烷酮的保留值增加,总体上呈现一个特微的U型的保留曲线。


图7


对于低乙腈比例流动相下的疏水作用,笔者比较了α-吡咯烷酮在SCX与C18上的保留差异。


图8


图8表明,α-吡咯烷酮在低乙腈比例流动相下在SCX上的保留甚至强于C18,这可能有极性相互作用的贡献,类似于大家常见到的极性化合物在含极性基团的C18固定相上保留要强于普通C18固定相。

 

高乙腈比例流动相下,SCX固定相往往呈现良好的类似HILIC保留作用。如图9所示,笔者曾以SCX作为固定相,以乙腈-0.05%磷酸水溶液作为流动相完美分离了极性化合物奥拉西坦及其诸多极性杂质。


奥拉西坦


图9


对于极性两性药物γ-氨基丁酸中极性杂质α-吡咯烷酮的分离,有报道采用C18色谱柱,运用离子对色谱法分离。该方法虽然提高了γ-氨基丁酸的保留,但极性杂质α-吡咯烷酮的保留仍不理想,另外由于运用到离子对试剂,加之测试波长较低(205nm),导致基线噪声较大,而且容易出现伪峰。通常的思路是采用氨基住进行分离,本文笔者采用SCX柱,综合运用阳离子交换和亲水作用原理,以50mmol/L磷酸二氢钾水溶液(pH2.1)-乙腈(98:2)为流动相,如图10所示,实现它们的满意分离与保留。


图10


四、关于SCX固定相的过载


组分在SCX固定相上的容量因子可以表达为:



V为不同固定相体积占比,k’为组分在相应的固定相上的容量因子。

 

容量因子来源于苯基和磺酸基两方面,柱过载也来源于这两个方面,即苯基作用位点的过载和磺酸基阳离子交换位点的过载,任何一方面的过载都会表现为柱过载。

 

阳离子在苯基位点上的过载,类似于离子组分在C18固定相上的过载。由于离子组分难以进入电中性的苯基固定相内部以及已经分配在苯基固定相的离子组分因为静电排斥作用会阻止离子组分的进一步分配的缘故,阳离子极易在苯基位点上过载。解决的办法通常是增加流动相中有机相比例,减小甚至消除组分在苯基的分配,分配减小或消除了,苯基位点上的过载也就缓解或消除了。


?如图11所示,对于疏水性较强的季铵盐类阳离子(1),以100%水相作流动相,主峰过载明显,增加流动相中乙腈比例至20%,柱过载明显缓解。


图11


磺酸基离子交换位点上的过载,可以通过调节流动相pH减小待分离组分解离程度来缓解,也可以通过增加流动相离子浓度减少阳离子组分在磺酸基离子交换位点上的分配来缓解。

 

当然,以上缓解过载的方法都会引起选择性的改变。有时候,疏水作用和低离子浓度的洗脱液甚至是大家分离时所必须运用到的,应该根据实际需要灵活调节。



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